食品微生物实验报告

霉菌的培养与形态学观察：实验一真菌培养基的配制与灭菌

实验目的：

（1）了解培养基的配置原理和方法，掌握分离培养微生物的有关准备工作。

（2）掌握高压灭菌方法及原理

实验原理：

（1）培养基的制备原理：

培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。

从营养角度分析：

营养：碳源、氮源、能源、生长素、水分和无机盐等；?适宜的酸碱度(pH值)和一定缓冲能力；?一定的氧化还原电位；?合适的渗透压。

琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。加琼脂制成的培养基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固，不容易被微生物污染。但多次反复融化，其凝固性降低。

（2）湿热灭菌原理－高压蒸汽灭菌

在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温

度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。

实验材料与方法

配制培养基所需器材

实验设备：高压蒸汽灭菌器。

实验器材：500ml三角烧瓶、蓝盖瓶、5ml刻度吸管、培养基、天平、砝码、

称量纸、药勺、500ml、100ml量筒、牛皮纸、硫酸纸、橡皮筋、铁丝筐、平皿、剪刀等。

培养基等集中放讲台前高压桶内，送到洗刷室统一高压灭菌条件及注意事项

高压灭菌条件：121.3℃，15min。含糖培养基113℃，15min。

倒平板电炉加热灭菌好的培养基打开平皿包装倒平板（10块）注意事项：空气环境无菌（应在酒精灯火焰周围无菌区）。

a.在酒精灯火焰处，倾斜打开瓶口。

b.瓶口要过火焰。

c.左手掀开平皿小口。

d.倾注满皿底再多一点，约10ml（7cm直径平皿）。

e.推放一边要轻缓，不能晃起琼脂挂壁，易在培养过程中污染杂菌。

f.完全凝固再翻转平板放塑料筐内，4℃备用。

分析与讨论

（1）如何证明培养基灭菌是否彻底?

把灭菌后的培养基按灭菌锅内的不同位置，每处抽取数管(瓶)，标上记号，置25℃～30℃培养一周左右进行检查。如果培养基没有什么变化，说明灭菌效果良好；如果某一位置的培养基出现了杂菌菌落，可能是摆放的太紧，导致蒸汽不畅，或锅的结构不合理等原因所致，应根据上述情况进行改进；如果大部分或全部菌种瓶都出现杂菌，说明灭菌温度或灭菌时间不够，应提高压力或延长灭菌时间。经过几次检验都证明能彻底灭菌后，以后按同样条件灭菌的则不必进行检查。

经过几次检验都证明能彻底灭菌后,以后按同样条件灭菌的则不必进行检查。

（2）为什么说消毒与灭菌是微生物学和临床医学必不可少的基本知识?由于病原生物广泛存在于自然界，可通过不同途径和媒介进入人体，引起感染或造成疾病流行。因此，杀灭或清除存在于体外传播媒介上的病原生物，对于切断传播途径、预防和控制其感染具有重要意义。自古以来，人们就利用煮沸、火烧、日晒等方法杀灭或去除微生物，达到预防疾病的目的。实际上，除了在临床医疗实践中需要防止微生物的污染或感染外，在微生物学实验室、食物保存、饮水净化、药品与生物制品生产等过程中都需要避免微生物的污染。

实验二霉菌的接种与培养

实验目的与要求：掌握霉菌与酵母菌的接种与培养方法。

实验原理：

接种是微生物实验及科学研究中一项基本操作技术。根据实验目的和要求，

选择合适的接种工具与接种方法，接种工具有接种环、接种针、接种铲、接种钩、吸管、滴管、棉签等。常用接种方法有：斜面接种，液体接种，穿刺接种，平板接种和固体接种。接种的关键是无菌操作。

无菌操作的原则：在酒精灯火焰旁进行，所有器皿均须严格消毒，培养基应事先做无菌试验，

接种工具使用前后须经火焰烧灼灭菌，棉塞不能乱放，始终夹在手指中。在培养四大类微生物时应注意选择适宜的培养条件。多数细菌为专性需氧菌与兼性需氧菌，少数为厌氧菌。多数食品腐败菌和工业用菌种，以及人和动物病原菌的最适生长温度为37℃，并且在近中性（PH6.5～7.5）条件下生长良好。多数放线菌为好氧菌，少数为厌氧菌，最适生长温度为28～30℃，多数适宜在偏碱性环境中生长（PH7.5～8.5）。

实验材料与方法

（1）实验材料：实验设备：温箱。

实验器材：毛霉、曲霉、青霉、根霉、啤酒酵母、白假丝酵母、新生隐球酵母菌、细黄链霉菌、PDA平板、高盐察氏平板、高氏合成I号平板、塑料筐、20%甘油水溶液、镊子、接种铲、无菌盖玻片、无菌滤纸、无菌载玻片、石棉网、牛皮纸、硫酸纸、橡皮筋、铁丝筐等。

（2）实验方法：平板接种：毛霉→PDA平板（点植法）

啤酒酵母→PDA平板（五区分离划线法）青霉、曲霉→PDA平板（连续划线法）

小室载玻片培养法：

1、取灭菌后小室平皿。

2、取无菌PDA琼脂薄层平板，用镊子夹住盖玻片切割成0.5～1.0cm2的琼脂块，并将其移至培养小室中的载玻片上，制作过程注意无菌。

3、用接种环取少量霉菌的孢子接种于培养基四周，用无菌镊子

将盖玻片覆盖在琼脂块上，并(转载于:l灭菌的20%甘油（用于保持湿度），盖上皿盖，标记，置28～30℃培养3～5d

粮食产品的平板接种：

1.取粮食样品20g,放入无菌烧杯，加无菌水洗涤，

反复10次，弃去水后，将粮粒倒于平皿内备用2.镊子取粮食种入PDA琼脂内，每皿可接种5-10粒。

放线菌的接种：取细黄链霉菌划线法接种，在接种的划线处，无

菌操作斜插入盖玻片数张。

注意事项：

1.空气环境无菌（应在酒精灯火焰周围无菌区）

2.在酒精灯火焰处，倾斜打开瓶口。

3.接种环使用前，直接在酒精灯上烧灼灭菌，把环和金属丝烧红即可。

4.接种环使用后，先在火焰周围把环上标本烤干，再烧灼灭菌，以免标本汽化，爆烈四溅，污染环境。5.金属杆快速通过火焰2－3次，杀灭表面微生物

分析与讨论

1、粮食中产毒真菌的种类及产生毒素？

青霉、毛霉、曲霉、根霉、酵母、白念、细黄链霉菌（放线菌）青霉素、丝生毛霉素、黄曲霉素、根霉素、白念菌素。细黄链菌素

2、常用霉菌培养基有哪些？

马铃薯蔗糖培养基

豆芽汁葡萄糖（或蔗糖）琼脂培养基察氏培养基

3、霉菌的接种方法有何不同？为什么？

（1）连续划线法（青霉、曲霉）

青霉与曲霉为局限性生长的霉菌。应采用连续划线接种法接种。（2）点植法（根霉、毛霉）

根霉与毛霉生长区域比较大，应采用点植法。（3）小室载玻片培养法（青霉、毛霉、根霉、曲霉）

实验三霉菌的制片与形态观察

实验目的：学习并掌握观察霉菌形态的基本方法；

了解四类常见霉菌的基本形态特征。了解放线菌的基本形态特征。

实验原理：霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多（约为3-10μm）,常是细

菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。霉菌菌丝较粗大，细胞易收缩变形，且孢子容易飞散，所以制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液，用此染液做霉菌制片的特点是细胞不变形，具有杀菌、防腐作用，不易干燥，能保持较长时间，能防止孢子四处飞散，棉兰具有一定的染色作用，染液的蓝色能增大反差。

实验材料：

（一）菌种：在马铃薯琼脂平板上培养3—4天的青霉(Penicilliumsp.)、曲霉(Aspergillussp.)、毛霉（Mucorsp.）、根霉；

（二）器材及用具：镊子、载玻片、盖玻片、显微镜。

实验方法：

（一）直接制片观察

于洁净载玻片上，用镊子取霉菌菌落的边缘处取小量带有孢子的菌丝，然后小心地盖上盖玻

片。置显微镜下先用低倍镜观察，必要时再换高倍镜（二）小室培养观察

将载玻片直接放低倍镜下观察，再换高倍镜观察。

观察原则：

毛霉：用低倍镜观察孢子囊梗、囊轴等。用高倍镜观察孢子囊孢子的形

状、大小。

根霉：菌丝、孢子同毛霉，注意观察有无假根。

曲霉：在高倍镜下观察菌丝有无隔膜，分生孢子着生位置，辨认分生孢

子梗、顶囊、小梗和分生孢子。

青霉：在高倍镜下观察菌丝有无隔膜，分生孢子梗、副枝、小梗和分生

孢子的形状等。实验结果：

分析与讨论：

青霉和曲霉的形态有哪些异同？

青霉常分布在霉腐变质的水果、蔬菜、粮食和皮革等物体上，菌体直立菌丝的顶端长有扫帚状的结构，结构的每一个分枝上，生有成串的孢子，成熟的孢子呈青绿色，进行孢子生殖。

曲霉广泛分布在谷物、空气和土壤中，曲霉直立菌丝的顶端膨大成球状，球状结构的表面放射状地生有成串的孢子，孢子随曲霉种类的不同而呈黄色、橙色或黑色。

从皮肤取材查真菌如何检查？

食品微生物综合实验报告

项目一：食品中细菌总数的测定

1.目的

本方法规定了食品中菌落总数的'测定方法。

本方法适合于各类食品中菌落总数的测定。

2.设备和材料

温箱：36±1℃。恒温水浴：46±1℃。电炉吸管。广口瓶或三角瓶：容量为500ml玻璃珠：直径约5mm。平皿：直径为90mm。试管。酒精灯。试管架。灭菌刀或剪子。灭菌镊子。

3.测定步骤

检样稀释及培养

（1）以无菌操作，将检样25g(或mL)剪碎放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1∶10的均匀稀释液。

（2）用1mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内(注意吸管尖端不要触及管内稀释液)，振摇试管，混合均匀，做成1∶100的稀释液。

（3）另取1mL灭菌吸管，按上条操作顺序，做10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支1mL火菌吸管。

（4）根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。

（5）稀释液移入平皿后，应及时将凉至46℃营养琼脂培养基(可放置于46±1℃水浴保温)注入平皿约15mL，并转动平皿使混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1mL稀释液的灭菌平皿内作空白对照

（6）待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h。菌落计数方法

做平板菌落计数时，可用肉眼观查，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。

菌落计数的报告

（1）平板菌落数的选择

选取菌落数在30～300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。平皿内如有链状菌落生长时(菌落之间无明显界线)，若仅有一条链，可视为一个菌落；如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。

（2）稀释度的选择

应选择平均菌落数在30～300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之。

若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30～300之间，则视两者之比如何来决定。若其比值小于或等于2，应报告其平均数；若大于2则报告其中较小的数字。

若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之。

若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

菌落数的报告

菌落数在100以内时，按其实有数报告，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩

4.出现的问题

①接种过程操作速度太慢，导致培养基与接种液无法充分混合。②平板划线不规律。③仪器使用不熟练，配合不够默契。

5.参照国标得出结论部分食品国标

短数字后面的零数，也可用10的指数来表示。

瓶（桶）装饮用水菌落总数限量是≤20CFUmL，/总大肠菌群（MPN/100mL或CFU/100mL）不得检出，耐热大肠菌群（MPN/100mL或CFU/100mL）不得检出，大肠埃希氏菌（MPN/100mL或CFU/100mL）不得检出常温液态奶≤10cfu/ml。

6.结论：

自来水（或啤酒）的培养基均未培养出菌落，表示自来水（或啤酒）中菌落总数合格。土壤（或污水）的培养基中发现有大量菌落，则自来水和啤酒中无超标现象，符合卫生标准。

项目二:细菌涂片制作及革兰氏染色技术

一．目的

学习金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等细菌涂片制作、干燥和固定技术。掌握细菌的简单染色和革兰氏染色技术

二．设备和材料

菌种

大肠杆菌16h牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，金黄色葡萄球菌16h牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物。

溶液和试剂

草酸铵结晶紫染液，革兰氏碘液，95%乙醇，番红复染液等。仪器和其他用品

酒精灯，载玻片，显微镜，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，接种环，试管架，镊子，载玻片夹子，滤纸，滴管和无菌生理盐水等。

三．测定步骤

1、细菌涂片制作

（1）涂片。用接种环从试管培养液中取一环菌，于载玻片中央涂成薄层即可，或先滴一滴无菌水于载玻片中央，用接种环从斜面挑出少许

（2）干燥。涂片后自然干燥，也可在酒精灯上略加热，使之迅速干燥。

（3）固定。固定的方法主要取决于勇什么染色方法，常用的有火焰固定法和化学固定法，火焰固定法的主要操作要领是：手持载玻片一端，标本面向上，在灯的火焰外侧迅速来回移动3~4次，约3~4s.

2、革兰氏染色法

涂片→干燥→草酸铵结晶紫（60s）→水洗→革兰氏碘液媒染（60s）→95%酒精脱色（30s）→水洗→番红（2min）→水洗→干燥→镜检。

脱色是革兰氏染色关键的一步，可直接用95%酒精冲洗脱色，直到流下的酒精无明显的紫色为止。然后，应立即用水冲洗，以避免脱色时间过长而影响最终染色结果。另外，挑菌量、固定温度、染色时间也是影响结果的重要因素，只有通过反复实践，才能获得满意的结果。